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Wissenschaftliche Berichte Band 13, Artikelnummer: 6996 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Mit der Phasenkontrast-Computertomographie können Weichteilproben kontrastreich dargestellt werden. Bei kohärenten Quellen gehören propagationsbasierte Bildgebungstechniken (PBI) zu den gebräuchlichsten, da sie einfach zu implementieren sind und hochauflösende Bilder erzeugen. Ihr Nachteil ist ein geringer Grad an quantitativen Daten aufgrund vereinfachender Annahmen über die Probeneigenschaften bei der Rekonstruktion. Diese Annahmen können vermieden werden, indem alternativ quantitative Phasenkontrasttechniken eingesetzt werden. Diese beeinträchtigen jedoch häufig die räumliche Auflösung und erfordern komplizierte Aufbauten. Um diese Einschränkung zu überwinden, haben wir einen neuen Bildgebungsaufbau entworfen und konstruiert, der einen 2D-Talbot-Array-Illuminator als Wellenfrontmarkierung und Speckle-basierte Bildgebungsphasenabruftechniken verwendet. Wir haben eine Nachbearbeitungskette entwickelt, die Wellenfrontmarkierungsdrifts kompensieren kann und die Gesamtempfindlichkeit verbessert. Durch den Vergleich zweier Messungen biomedizinischer Proben zeigen wir, dass die räumliche Auflösung unseres Aufbaus mit der von PBI-Scans vergleichbar ist und gleichzeitig in der Lage ist, eine Probe erfolgreich abzubilden, die die typische Homogenitätsannahme von PBI verletzt.

Im Laufe der Jahre wurden verschiedene Bildgebungstechniken entwickelt, die es Synchrotron-Bildgebungsexperimenten ermöglichen, die Phasenverschiebungseigenschaften eines Objekts auf mikroskopischer Ebene zu visualisieren. Zu den Vorteilen solcher Techniken gehört ein stark verbesserter Weichteilkontrast1. Zu den Implementierungen der Phasenkontrast-Mikrocomputertomographie (CT) gehören inzwischen propagationsbasierte Bildgebungstechniken (PBI)2, gitterbasierte Phasenkontrastbildgebung (GBI)3, Kantenbeleuchtung4, Hartman-Shack-Masken5 und als jüngste Ergänzung , unter anderem die Speckle-based Imaging (SBI)-Techniken6,7. Während alle diese Methoden auf den phasenschiebenden Eigenschaften der Probe basieren, unterscheiden sie sich stark hinsichtlich der experimentellen Anforderungen und der Implementierung sowie der Nachbearbeitungsalgorithmen.

PBI-Techniken lassen sich vergleichsweise einfach in ein bestehendes Setup implementieren. Die Phasenverschiebung kann aus einer einzelnen Messung ermittelt werden, vorausgesetzt, dass vereinfachende Annahmen über die Probe angewendet werden können, beispielsweise die Annahmen über ein einziges Material oder die vernachlässigbare Dämpfung8. Wenn diese Annahmen jedoch nicht anwendbar sind, wird die Phasenwiederherstellung komplexer. Dies kann die Kompatibilität mit anderen Untersuchungsmethoden beeinträchtigen. Konventionelle histologische Untersuchungen nutzen die Färbung zur Identifizierung funktioneller Strukturen. Diese Farbstoffe binden nur an bestimmte Strukturen, anstatt sich nur in der Probe anzusammeln. Dieser Ansatz wurde auch auf die Röntgenbildgebung übertragen, wobei die Kompatibilität mit der visuellen Lichtmikroskopie erhalten blieb9,10. Da diese Flecken die Absorptionseigenschaften der Probe verändern, können sie die allgemeinen Phasenrückgewinnungsannahmen von PBI beeinträchtigen. Für eine PBI-Phasengewinnung über eine einzelne Distanz wird häufig davon ausgegangen, dass die Probe entweder transparent ist oder aus einem einzigen Material besteht. Bei der Zugabe stark absorbierender Beizen können diese Annahmen nicht mehr erfolgreich angewendet werden. Im Gegensatz dazu können strahlmodulierte Differenzphasenkontrastverfahren, wie z. B. SBI, das Phasensignal ohne Annahmen über die Probe abrufen. Ihre Nachteile liegen meist in der Komplexität des Aufbaus oder ihrem Einfluss auf die Ortsauflösung durch die optischen Elemente.

In den letzten Jahren wurden neuartige Speckle-Tracking-Algorithmen entwickelt, die SBI zu einem allgemeinen Begriff für Phasenkontrastverfahren machen, die einen zufälligen Wellenfrontmodulator verwenden. Während implizite Tracking-Methoden11,12 eher mit PBI verwandt sind, basieren explizite Methoden13,14 wie die Unified Modulated Pattern Analysis (UMPA) auf Korrelationsanalyse oder Kostenfunktionen, um die Bildsignale abzurufen, und sind Teil der differentiellen Phasenkontrastmethoden. Durch Ersetzen des zufälligen Speckle-Musters durch eine periodische Struktur, z. B. ein 2D-Talbot-Array-Illuminator-Phasengitter (TAI), kann die Sichtbarkeit der Wellenfrontmarkierung verbessert werden, was effizientere Scans ermöglicht15.

Für die biomedizinische Bildgebung kommen alle oben genannten Methoden zum Einsatz. Die Wahl des geeigneten Setups hängt oft von mehreren Parametern ab. Aufbauabhängige Eigenschaften wie Komplexität, Messzeit und Rechenaufwand für die Phasenwiederherstellung unterscheiden sich und müssen bei der Gestaltung eines Experiments berücksichtigt werden. Auch die genaue Fragestellung an einer Probe kann bestimmte Methoden erfordern oder ausschließen, da Ortsauflösung, Phasenempfindlichkeit und die Fähigkeit, quantitative Informationen über die Probe zu sammeln, von der Methode abhängen. Während PBI hochauflösende Scans liefert, ist seine Empfindlichkeit im Vergleich zu den Differential-Phasenkontrast-Techniken geringer16,17. GBI ist in der Lage, quantitative Phaseninformationen bereitzustellen, führt jedoch aufgrund der optischen Elemente typischerweise zu einem Auflösungsverlust. Für SBI hängen die Eigenschaften von der Wahl des Tracking-Algorithmus ab. Mit der neuesten Erweiterung der expliziten Speckle-Tracking-Algorithmen, der Unified Modulated Pattern Analysis (UMPA), hat SBI seine Anwendungsmöglichkeiten für die Phasenkontrast-CT mit hoher räumlicher Auflösung18 unter Beweis gestellt und liefert dennoch quantitative Daten.

In dieser Arbeit wenden wir unseren neuartigen Aufbau (vgl. Abb. 1a) an der Strahllinie P05 am Speicherring PETRA III an, der vom Deutschen Elektronen-Synchrotron (DESY) betrieben wird, und verwenden TAIs als Wellenfrontmarker in Kombination mit UMPA als Phasenabfrage zum Scannen von zwei biomedizinischen Proben. Dabei vergleichen wir die Bildqualität und räumliche Auflösung des neuen Aufbaus mit der üblichen ausbreitungsbasierten Phasenwiederherstellung unter der Annahme eines einzelnen Materials. Am Beispiel des Scannens einer gefärbten Weichteilprobe zeigen wir ein Beispiel dafür Einschränkungen der Homogenitätsannahme von PBI und zeigen, wie quantitative Phasenkontrastmethoden in solchen Fällen Vorteile haben können.

Im Vergleich zu früheren Arbeiten haben wir unser Scanverfahren geändert. Durch die Umstellung auf kontinuierliche Rotationsscans (Flyscans) wurde die Scanzeit verkürzt. Die Änderung des Flat-Field-Synthetisierungsprozesses auf die Verwendung von Eigen-Flat-Field-Bildern19 verbesserte die Empfindlichkeit einzelner Projektionen erheblich. Eine Beispielprojektion ist in Abb. 1b und c dargestellt. Der Scan verwendete 16 Wellenfrontmarkierungspositionen und ein UMPA-Fenster von \(3\, \times\) 3 Pixeln. In Abb. 1b ist die Differenzphase in x-Richtung dargestellt, wenn ein mittleres Flachfeldbild verwendet wird. Der Hintergrund zeigt Reste der Gitterstruktur. In Abb. 1c ist derselbe Bereich dargestellt, wenn 15 Hauptkomponenten zur Synthese eines Flachfeldbildes verwendet wurden. Der Hintergrund erscheint glatt. Die Empfindlichkeit in der Projektion lag mit dem mittleren Flatfield-Bild bei 500 nrad, mit den Eigenflat-Field-Bildern bei 268 nrad.

Schematische Darstellung des Aufbaus in (a). Der hexagonale TAI mit einer Periode \(p=10~{\upmu {\hbox {m}}}\, einem Tastverhältnis von DC = 1/3 und einer Phasenverschiebung von \(\phi =\frac{2 \pi }{3}\) wird mit einem Bruchteil des Talbot-Abstands von 1/6 d\(_T\) = 0,54 m (bei einer Strahlenergie von 20 keV) zum Detektor platziert. Die Probe wird dazwischen auf dem Rotationstisch montiert. A markiert einen nicht gebrochenen Strahl. Wenn ein Strahl die Probe passiert, wie in B gezeigt, wird er von seinem ursprünglichen Weg gebrochen (graue gestrichelte Linie) und das Muster auf dem Detektor wird verschoben, wie durch den magentafarbenen Pfeil in C gezeigt. Um einen vollständigen Scan aufzuzeichnen, werden mehrere Drehungen durchgeführt , indem der TAI zwischen Drehungen entlang der Gitterachsen in Bruchteilen einer Gitterperiode schrittweise erhöht wird, wie in D gezeigt. Die Schritte werden dann verwendet, um den Verschiebungsvektor für jedes Pixel mithilfe von UMPA zu bestimmen. In (b) und (c) wird ein Vergleich eines Differenzphasenbildes unter Verwendung eines mittleren Flachfeldbildes in (b) und eines optimierten Flachfeldbildes in (c) gezeigt. Der Scan verwendete 16 TAI-Positionen und wurde mithilfe eines UMPA-Fensters mit 3 Pixeln abgerufen. Bei der Optimierung wurden insgesamt 15 Eigenflats verwendet. Die Empfindlichkeit (vgl. Gleichung 3) des Bildes in (b) liegt bei 500 nrad, in (c) bei 268 nrad.

Die erste Beispielmessung bestand darin, die Auflösung der Phasenkontrastbildgebung mit unserem TAI-basierten Aufbau und der UMPA-Phasenabfrage mit PBI zu vergleichen. Wir haben einen Abschnitt menschlichen Lungengewebes aus pathologischen Proben eines tödlichen COVID-19-Falls gescannt. Die Probe wurde in Paraffinwachs eingebettet und an der Bildgebungsstrahllinie P05 des Helmholtz-Zentrums Hereon bei PETRA III, DESY, gescannt. Die aufgezeichneten Daten wurden für verschiedene UMPA-Fenstergrößen verarbeitet und die Auflösung bei jeder Verarbeitungseinstellung wurde bestimmt. Aus demselben Datensatz wurde ein PBI-Phasenabruf durch Mittelung über die Phasenschritte des TAI-Scans berechnet und auf ähnliche Weise rekonstruiert.

Vergleich eines Lungengewebeproben-Scans mit dem TAI und dem gleichen Datensatz, der mit PBI-Methoden phasenweise abgerufen wurde. In (a) ist der TAI-Scan dargestellt, dessen Phase mithilfe von UMPA mit einer Fenstergröße von \(3\,\times\)3 Pixel abgerufen und in Einheiten der Elektronendichte umgerechnet wurde. In (b) wird derselbe Datensatz mithilfe eines regulierten PBI-Ansatzes mit einem Regularisierungsparameter von 2,4 phasenweise abgerufen. In den Diagrammen (c) und (d) wird die Kantenschärfe beider Phasenwiederherstellungsmethoden verglichen. Die Kanten wurden mit einer Gaußschen Fehlerfunktion angepasst und die volle Halbwertsbreite (FWHM) wird verglichen. In (c) ist die mittlere Schärfe mehrerer Kanten für verschiedene UMPA-Fenstergrößen dargestellt. In (d) werden verschiedene PBI-Regularisierungsparameter verglichen. Die vertikalen Linien markieren die für die Bilder in (a) und (b) verwendeten Parameter.

Die Rekonstruktionen mit beiden Methoden sind in Abb. 2 dargestellt. In Abb. 2a ist eine Übersicht der Lungenprobe unter Verwendung eines \(3\, \times\) 3 Pixel großen UMPA-Fensters dargestellt. Beim Vergrößern werden Details von Blutgefäßen mit geronnenem Blut darin gezeigt. Das gleiche Slice-Phasenabruf mit einer regulierten ausbreitungsbasierten Phasenabfrage ist in Abb. 2b dargestellt. Ein \(7\,\times\) 7-Pixel-Abschnitt des Gefäßes wurde verwendet, um das Kontrast-Rausch-Verhältnis (CNR) zum Einbettungsmaterial zu bestimmen. Für den TAI-Scan lag dieser bei CNR\(_{TAI}=18,7\), für den PBI-Scan bei CNR\(_{PBI}=23,1\).

Die Schichten in Abb. 2 wurden auf ihre räumliche Auflösung analysiert. Mithilfe der Fourier-Ring-Korrelation (FRC)20,21 wurde die räumliche Auflösung des TAI-Scans auf 4,75 \({\upmu {\hbox {m}}}\) bei einem Vollbit-Auflösungskriterium und 4,35 \({\ upmu {\hbox {m}}}\) Halbbit bzw. Die Auflösung des PBI-Scans wurde auf 4,70 \({\upmu {\hbox {m}}}\) Vollbit- und 4,15 \({\upmu {\hbox {m}}}\) Halbbit-Auflösung festgelegt. Um den Einfluss der Verarbeitungseinstellungen zu vergleichen, wurde die Kantenschärfe im Bild für verschiedene UMPA-Fenstergrößen und PBI-Regularisierungsstärken verglichen. Dies wurde durch Anpassen einer Gaußschen Fehlerfunktion (ERF) an die Kanten erreicht. Die Ergebnisse sind in Abb. 2 dargestellt. In Abb. 2c wird der Effekt des UMPA-Fensters für Fenstergrößen zwischen 1 × 1 Pixel und 17 × 17 Pixel analysiert. Das in Abb. 2a gezeigte Segment verwendete ein \(3\,\times\) 3-Pixel-Fenster. Dies führte zu einer mittleren Halbwertsbreite (FWHM) des ERF von 4,01 ± 0,69 \({\upmu {\hbox {m}}}\). Die Regularisierungsstärke des Bildes in Abb. 2b führte zu einem mittleren FWHM von 4,65 ± 0,60 \({\upmu {\hbox {m}}}\). Bei beiden Phase-Retrieval-Methoden zeigt sich eine starke Abhängigkeit der Kantenschärfe von den Einstellungen.

Um die Grenzen der gängigen PBI-Annahme eines homogenen Materials auszunutzen, haben wir eine Mäuseniere gescannt, die mit einem Bismut-basierten Farbstoff modifiziert wurde22. Die resultierenden Bilder sind in Abb. 3a und b dargestellt. In Abb. 3a zeigt der Phasenkontrastscan mit einem TAI keine derartigen Artefakte durch die Fleckenablagerung. Die Fleckenansammlung im Zentrum führt zu einem leichten Anstieg der lokalen Elektronendichte. In Abb. 3b ist die regulierte PBI-Phasenwiederherstellung dargestellt, die starke Gradienten zu den Rändern der Probe sowie Artefakte in der Mitte zeigt.

Die Histogramme der Bilder Abb. 3a und b sind in Abb. 3c und d dargestellt. Die blaue Kurve zeigt das Histogramm, berechnet anhand von 200 Bins im angezeigten Fenster. Die gestrichelte rote Linie zeigt eine Anpassung des Histogramms anhand der Summe von drei Gaußschen Funktionen, die unten einzeln dargestellt sind. Der erste Peak entspricht dem einbettenden Paraffin, der zweite Peak dem Mark und dem umgebenden Gewebe und der dritte Peak dem Kortex.

Vergleich der quantitativen Phasenkontrastbildgebung mit einem TAI in (a) mit einer regulierten PBI-Phasenabfrage in (b). Bei der Probe handelte es sich um eine Mäuseniere, die im Rahmen einer früheren Untersuchung mit einem Bismut-basierten Färbemittel angefärbt wurde22. Vergrößerungen zeigen einen Teil des äußeren Marks. Die PBI-Phasenwiederherstellung in Diagramm (b) zeigt starke Artefakte dort, wo sich der Fleck in der Mitte sowie an den Rändern der Probe ansammelt. Im Gegensatz dazu zeigt die Phasenabfrage aus den TAI-Daten in (a) nur einen leichten Anstieg der Elektronendichte in den betroffenen Bereichen, aber keine Artefakte. Diagramme (c) und (d) vergleichen die Histogramme beider Bilder. Die blaue Linie zeigt das mit 200 Bins berechnete Histogramm im angezeigten Fenster. Die rote gestrichelte Linie entspricht einer Anpassung des Histogramms unter Verwendung der Summe der drei Gaußschen Peaks, die unten angezeigt werden. Die Peaks entsprechen verschiedenen Materialien im Scan. Von links nach rechts entspricht der graue Peak dem Einbettungswachs, der hellblaue Peak dem Mark und der dunklere blaue Peak dem Kortex.

Beim Vergleich der Phase-Retrieval-Methoden für den Scan des Lungengewebes in Abb. 2 ergibt sich ein ähnlicher Gesamteindruck für TAI-Phase-Retrieval und PBI. In den PBI-Bildern ist eine gewisse Restkantenverstärkung zu finden, z. B. innerhalb der Gefäßwände in Abb. 2b. Dies deutet auf einen Kompromiss zwischen ausreichender Regularisierungsstärke und noch nicht dominanter Unschärfe hin. Der TAI-Scan liefert ein homogenes Bild über die gesamte Probe. Wenn jedoch strukturelle Informationen gewünscht sind, bieten beide Methoden einen ähnlichen Detaillierungsgrad. Die erreichte räumliche Auflösung liegt sowohl für die FRC als auch für die Kantenschärfe bei beiden Phasenwiederherstellungsmethoden nahe beieinander. PBI bietet bei den gewählten Parametereinstellungen ein etwas höheres CNR als der TAI-Abruf.

Wenn PBI und seine Annahmen über die Probe an ihre Grenzen stoßen, können in den Bildern Artefakte sichtbar werden. Dies war der Fall, als wir eine gefärbte Mäuseniere scannten. Die resultierenden Bilder werden in Abb. 3 verglichen. Die PBI-Phasenwiederherstellung in Abb. 3b zeigt starke Gradienten zu den Rändern sowie Artefakte, bei denen sich der Fleck in der Mitte ansammelt. Aufgrund der Verfärbung ist das Absorptionsverhalten lokal unterschiedlich und die Annahme eines einzelnen Materials ist nicht mehr zutreffend. Im Gegensatz dazu erfordert die TAI-Phasenabfrage (Abb. 3a) keine vorherigen Annahmen und kann die Variationen viel besser bewältigen. Die Vergrößerungen zeigen Unschärfen und Inhomogenitäten im PBI-Scan. Der Unterschied wird auch sichtbar, wenn man die Histogramme beider Bilder vergleicht. Für den TAI-Scan in Abb. 3c sind drei Peaks sichtbar, die dem Einbettwachs (grauer Peak), der Medulla und dem umgebenden Gewebe (hellblauer Peak) und der Kortikalis (dunkelblauer Peak) zugeordnet werden können. Die entsprechenden Peaks können auch den PBI-Phasenabrufdaten in Abb. 3d zugeschrieben werden, aber diejenigen, die der Medulla und dem Kortex entsprechen, weisen eine verschobene Position und eine stärkere Überlappung auf. Die Spitze des Kortex ist viel breiter und reicht in Richtung höherer Werte. Dies entspricht den Bereichen, in denen sich der Fleck angesammelt hat und die nun gesättigt sind. Im Vergleich zu den PBI-Daten zeigt das TAI-Histogramm eine viel klarere trimodale Verteilung der Werte, die die drei Bereiche der Stichprobe repräsentieren.

In unserem Vergleich nehmen wir den Durchschnitt über alle Phasenschritte, um das Ausbreitungsbild zu berechnen. Dadurch wird das Gittermuster verwischt, es kann aber in gewissem Maße immer noch zu Ringartefakten in der Rekonstruktion kommen. Um dies vollständig zu beseitigen, müssen zwei separate Messungen ohne Modulator im Strahl für den PBI-Scan verglichen werden. Durch die ungleichmäßige Beleuchtung durch den Wellenfrontmarker kann die Ortsauflösung beeinflusst werden. Wenn wir jedoch die gemessene räumliche Auflösung für eine niedrige Regularisierungsstärke berücksichtigen, nähert sich die Messung der Systemauflösung an. Daher werden die Auswirkungen des TAI als gering eingeschätzt. Andererseits kann das CNR der Messungen beeinflusst werden, da die Ringartefakte das Hintergrundrauschen beeinflussen. Insbesondere für den PBI-Scan können die ermittelten Werte nur als grobe Schätzung dessen angesehen werden, was möglich ist, da auch andere Faktoren, wie beispielsweise eine erhöhte Photonenstatistik durch Mittelung von 16 Scans, die Werte beeinflussen können.

Die in dieser Arbeit gezeigten Daten wurden nicht bei der hinsichtlich der räumlichen Auflösung optimalsten Konfiguration der Strahllinie aufgezeichnet. Dies erfordert die Verwendung dünnerer Szintillatoren, die Abstimmung von Mikroskop und Kamera sowie die Erzielung größerer Projektionswinkel. Der limitierende Faktor für die räumliche Auflösung ist das Lichtmikroskop der Kamera bei etwa 1 \({\upmu {\hbox {m}}}\). Dies lässt das Potenzial für weitere Auflösungsverbesserungen offen, falls dies zur Visualisierung einer Probe erforderlich ist.

Im Vergleich zu herkömmlichen GBI-Setups mit mehreren Gittern ist unser Setup-Design einfach zu implementieren und erfordert nur einen Wellenfrontmarker, ähnlich wie SBI. Die Verwendung eines TAI anstelle anderer Wellenfrontmarker sorgt für eine hohe Sichtbarkeit auf einer definierten Längenskala und Flusseffizienz. In Kombination mit der regelmäßigen Beschaffenheit des Gittermusters kann der Phasenschritt so optimiert werden, dass weniger Schritte erforderlich sind, um eine gute Empfindlichkeit zu erreichen. Im Gegensatz zu zufälligen Wellenfrontmarkern kann die periodische Struktur der Gitter Probleme verursachen, wenn eine Phasenumhüllung auftritt, und daher eine willkürliche Erhöhung der Empfindlichkeit verhindern. Um Phasenwiederherstellungsprobleme an Kanten zu vermeiden, kann die Probe in einem Einbettungsmedium gemessen werden oder die Ausbreitungsstrecke kann verringert werden. Der Aufbau wurde für einen flexiblen Energiebereich zwischen 15 und 75 keV konzipiert und deckt eine breite Klasse von Probensystemen ab, von biomedizinischen bis hin zu materialwissenschaftlichen Proben.

Durch die Änderungen bei der Scanaufzeichnung und -verarbeitung wurden die Scans schneller, stabiler und empfindlicher. Aufgrund kontinuierlicher Rotationsscans wurde die Scandauer von zuvor gemeldeten 5 Stunden und 15 Stunden auf etwa 2 Stunden verkürzt. Ein großer Einflussfaktor auf die Setup-Empfindlichkeit ist die Positionsstabilität der Gitter. Unser Ansatz zur Synthese von Flachfeldbildern kann Wellenfrontmarkierungs- oder Strahldrifts bis zu einem gewissen Grad kompensieren und erhöht so die Empfindlichkeit im Vergleich zu mittleren Flachfeldbildern auf fast die Hälfte. Dies verbessert das Rauschen bei der Rekonstruktion, reduziert Ringartefakte durch Reduzierung statischer Muster in den phasenabgerufenen Bildern und verbessert die Gesamtbildqualität. Darüber hinaus kann die Empfindlichkeit des Aufbaus an die Anforderungen der Probe angepasst werden, indem die Aufbaugeometrie, die Anzahl der Wellenfrontmarkierungspositionen oder die Phasenabrufeinstellungen angepasst werden.

Für zukünftige Arbeiten können die quantitativen Daten von SBI weiter genutzt werden. Zusammen mit quantitativen Absorptionsdaten ist eine Materialzersetzung möglich und kann neue Erkenntnisse über die räumliche Verteilung von Materialien liefern.

Bei den im Rahmen dieser Arbeit untersuchten Proben handelte es sich um ein Stück menschliches Lungengewebe und eine Mäuseniere. Das menschliche Lungengewebe wurde als Exponat einer forensischen Untersuchung nach einem COVID-19-Todesfall vom Institut für Rechtsmedizin der Ludwig-Maximilians-Universität München gewonnen. Die Ethikkommission der Ludwig-Maximilians-Universität, Medizinische Fakultät, verzichtet auf die Notwendigkeit einer ethischen Genehmigung und die Notwendigkeit einer Einwilligung nach Aufklärung (interne Referenznummer 22-0572 KB). Alle Untersuchungen erfolgten im Einklang mit den einschlägigen Richtlinien und Vorschriften.

Für die Mäuseniere wurde die Tierhaltung und Organentnahme am Klinikum rechts der Isar der Technischen Universität München nach den Richtlinien der Europäischen Union 2010/63 und mit Genehmigung eines internen Tierschutzausschusses des Zentrums für Präklinische Forschung des Klinikums durchgeführt rechts der Isar, München, Deutschland (interne Referenznummer 4-005-09). Nach der Entnahme wurde die Probe in einer Formaldehydlösung fixiert und mit einem Bismut-Oxo-Cluster22 angefärbt. Nach einer Dehydrierungsserie wurde die gefärbte Probe in Paraffinwachs eingebettet und zum Scannen montiert. Alle Verfahren entsprachen den relevanten Richtlinien und Vorschriften sowie den ARRIVE-Richtlinien23.

Der Aufbau wurde an der Mikrotomographie-Endstation der Bildgebungsstrahllinie P05 des Helmholtz-Zentrums Hereon bei PETRA III, DESY24,25,26 implementiert. Eine Undulatorquelle in Kombination mit einem Doppelkristallmonochromator wurde verwendet, um einen hochkohärenten monochromatischen Strahl mit einer Photonenenergie von 20 keV bereitzustellen. Als Kamera kam eine Ximea CB500MG mit einem CMOSIS CMV50000 Sensor und 7920x6004 Pixel zum Einsatz, mit einer physikalischen Pixelgröße von 4,6 \({\upmu {\hbox {m}}}\). Das Sehfeld ist bei einem fünffach vergrößernden Objektiv durch die Strahlhöhe auf ca. 3 mm, die maximale Breite bei dieser Vergrößerung beträgt 7,29 mm. Die Ortsauflösung des Detektorsystems wurde während der Fokussierung auf ca. bestimmt. 1,9 \({\upmu {\hbox {m}}}\). Um die Designgrenze des Mikroskops von ca. zu erreichen. 1 \({\upmu {\hbox {m}}}\) müsste das System angepasst werden, was die Verwendung dünner Szintillatorschirme und das Schließen von Kameraöffnungen beinhaltet, was zu einer geringeren Lichteffizienz führt. Dies wurde für die Scans in dieser Arbeit nicht durchgeführt. Ein ähnlicher Aufbau ist an der Hochenergie-Materialwissenschafts-Beamline P07 bei PETRA III für höhere Photonenenergien verfügbar.

Als Wellenfrontmarkierungen für SBI werden üblicherweise Sandpapier oder Stahlwolle verwendet. Um absorbierende Elemente zu vermeiden, können phasenschiebende Gitterstrukturen verwendet werden, um der Wellenfront ein Muster aufzuprägen27,28. Wir haben unseren Wellenfrontmarker so angepasst, dass er ein 2D-Phasenverschiebungsgitter verwendet, einen Talbot Array Illuminator (TAI)15,29. Das Gitter hatte eine Periode von 10 \({\upmu {\hbox {m}}}\, ein Tastverhältnis von \(DC=1/3\) und eine Phasenverschiebung von \(\phi =\frac{ 2\pi }{3}\), mit einer hexagonalen Gitterstruktur. Die Gitter wurden auf 200 \({\upmu {\hbox {m}}}\) dicken Siliziumwafern hergestellt, wobei durch tiefes reaktives Ionenätzen runde Löcher mit geeigneter Tiefe erzeugt wurden. Der Arbeitszyklus gibt das Verhältnis von Lochabstand zu Lochradius an. Bei fraktionalen Talbot-Abständen von \(\frac{1}{6}d_T\) zeigen diese TAIs einen fokussierenden Effekt mit einem theoretischen Kompressionsverhältnis von 1:3 in jede Richtung, wodurch eine hohe Sichtbarkeit erreicht werden kann. Durch die Verwendung von TAIs als Wellenfrontmarker konnten absorbierende Elemente vermieden und ein effizientes zweidimensionales Stepping angewendet werden. Die periodische Natur solcher Gitter impliziert ein ideales, regelmäßiges Schrittschema, das eine quadratische Anzahl von Wellenfrontmarkierungspositionen verwendet. Das Stepping erfolgte mit einem 2D-Piezo-Stepper, der aus Stabilitätsgründen direkt mit der Granitstruktur des Detektors verbunden war. Durch den Austausch des Gitters und die Verwendung unterschiedlicher Ätztiefen wurde der Aufbau bereits bei P05 und P07 in einem Energiebereich zwischen 15 und 75 keV erfolgreich getestet.

Die Proben wurden auf einem luftgelagerten Rotationstisch zwischen dem Wellenfrontmarker und dem Detektor montiert. Die Gitter wurden 155 mm vor der Probe montiert, der Abstand von Probe zu Detektor betrug 180 mm für die Lungenprobe und 160 mm für die Nierenprobe. Der Gesamtabstand weicht vom Bruchteil des Talbot-Abstands von 538 mm ab und stellt einen Kompromiss zwischen Mustersichtbarkeit, Setup-Empfindlichkeit und Scan-Artefakten aufgrund von Kanteneffekten dar. Da die Kantenverstärkung nicht im UMPA-Speckle-Tracking-Modell enthalten ist, verursachen zu starke Streifen Artefakte an Kanten und daher verkürzt sich der Abstand von der Probe zum Detektor. Der Abstand vom Gitter zur Probe wurde innerhalb der Grenzen des Aufbaus maximiert. Die Sichtbarkeit des Wellenfrontmarkers lag bei etwa 0,5. Bei gegebener Detektorauflösung liegt der Abstand der Proben zum Detektor unter dem kritischen Abstand für PBI30.

Im Vergleich zu früheren Arbeiten15 wurden die Scans nun im kontinuierlichen Rotationsmodus aufgezeichnet. Mehrere Wellenfrontmarkierungsschritte werden durch die Aufzeichnung mehrerer Scans realisiert, wobei die Position der Wellenfrontmarkierung zwischen den Scans geändert wird. Zu Beginn und am Ende jedes Scans wird ein Satz von 50–100 Flatfield-Bildern aufgenommen. Dies verbessert die Scanzeit und die Setup-Stabilität, da weniger Motoren angetrieben werden müssen.

Die Scans wurden bei einer Strahlenergie von 20 keV und einer Drehung um 180 Grad durchgeführt. Für das Lungengewebe wurden 4001 Projektionen mit einer Belichtungszeit von jeweils 110 ms bei kontinuierlicher Rotation der Probe aufgenommen. Insgesamt wurden 16 Wellenfrontmarkierungspositionen gescannt. Die Mäuseniere wurde mit 2001 Projektionen bei 80 ms pro Bild vermessen, ebenfalls mit 16 Wellenfrontmarkierungspositionen. Der Detektor verwendete einen 100 \({\upmu {\hbox {m}}}\) CdWO\(_4\)-Szintillatorbildschirm und ein Objektiv mit fünffacher Vergrößerung, was zu einer effektiven Pixelgröße von 0,92 \({\upmu { \hbox {m}}}\).

Die aufgenommenen Bilder wurden hinsichtlich Kamera-Dunkelstrom und Intensitätsschwankungen des Strahls korrigiert. Da SBI erfordert, dass Referenzbilder genau an der gleichen Wellenfrontmarkierungsposition wie die Probenprojektionen aufgenommen werden, war eine Korrektur für Wellenfrontmarkierungsungenauigkeiten und -drifts erforderlich. Hierzu wurde eine Hauptkomponentenanalyse (PCA) an den Flachfeldbildern jeder Gitterposition \(f_j\)19 durchgeführt. Dies ergibt mehrere sogenannte Eigenflat-Field-Bilder \(u_k\) und ihre entsprechenden Eigenwerte. Mithilfe eines Scree-Plots wurden die wichtigsten M-Komponenten, in diesem Fall 15, ausgewählt und die übrigen Komponenten verworfen.

Um ein am besten passendes Referenzbild an einer unbekannten Position des Wellenfrontmarkers zu erzeugen, kann ein neues Referenzbild \(f_n\) durch das gemittelte Referenzbild \(\bar{f_j}\) als gewichtete Summe über ausgedrückt werden Relevante Komponenten:

Die optimalen Gewichte \(w_k\) wurden berechnet, indem eine Kostenfunktion in einem Hintergrundbereich der Projektion \(p_{BG}\) definiert wurde. Mithilfe einer Minimierung der Differenz zwischen der Projektion und dem Flachfeldbild nach der Methode der kleinsten Quadrate werden die Gewichtungen bestimmt:

Die resultierenden Gewichte wurden verwendet, um das Referenzbild gemäß Gl. zu erzeugen. 1. Ein Vergleich der Wirkung der Eigenflat-Korrektur im Vergleich zur Verwendung von Mean-Flat-Field-Bildern ist in Abb. 1b und c zu sehen.

Die Projektionsbilder und die berechneten Referenzbilder wurden dann mithilfe der Unified Modulated Pattern Analysis (UMPA)14 phasenabgerufen. Der Scan wurde für unterschiedliche UMPA-Fenstergrößen zwischen \(1\times 1\) und \(17\times 17\) Pixeln ausgewertet. Die Winkelempfindlichkeit \(\sigma _{x/y}\), die dem kleinsten auflösbaren Brechungswinkel entspricht, kann aus dem Rauschen in einem Hintergrundbereich unter Verwendung der Standardabweichung (STD) des Brechungswinkelsignals berechnet werden:

wobei \(u_{x/y, BG}\) das berechnete Pixelverschiebungssignal bezeichnet, \(p_{eff}\) die effektive Pixelgröße und \(d_{prop}\) die Ausbreitungsentfernung von der Probe zum Detektor .

Die resultierenden Differenzphasenbilder wurden hinsichtlich Rampen und Ausreißern korrigiert, antisymmetrisch gespiegelt31 und mithilfe eines Fourier-Ansatzes32 integriert. Nach der Integration wurde die Phase auf Ringartefakte gefiltert und über gefilterte Rückprojektion und einen Ram-Lak-Filter mit der Software X-Aid (Mitos GmbH, Garching, Deutschland) rekonstruiert.

Die Bilder für PBI wurden berechnet, indem der Mittelwert über alle Phasenschritte gebildet wurde. Daher ist das Gittermuster nicht mehr sichtbar und ein regulierter Ansatz, basierend auf der Transport of Intensity Equation8,33, wurde verwendet, um die Phase abzurufen. Die Regularisierungsstärke für den gezeigten Schnitt wurde aufgrund des visuellen Eindrucks ausgewählt, bei dem innerhalb der Probe keine Kantenverstärkung mehr sichtbar war und die Unschärfe noch nicht vorherrschte. Die Projektionen wurden mit den gleichen Einstellungen wie für die TAI-Bilder rekonstruiert.

Die Bestimmung der räumlichen Auflösung der Bilder ist nicht trivial, da in den Bildern mehrere Effekte vorhanden sind. Die Rohdaten enthalten eine Kantenverstärkung, wohingegen die phasenabgerufenen Daten in gewissem Maße unscharf sind. Deshalb haben wir mehrere Methoden zur Messung der räumlichen Auflösung verglichen.

Die erste Methode ist die Messung der Kantenschärfe. In den rekonstruierten Schichten wurden mehrere Kanten ausgewählt und eine Fehlerfunktion (ERF) angepasst. Als Auflösungskriterium kann die FWHM des zugehörigen Gaußschen des ERF verwendet werden, was ca. entspricht. \(\textrm{FWHM}\ungefähr 2,35\,\sigma\). Diese Methode ist in der Lage, Unschärfen effizient zu erkennen, allerdings können die Werte verfälscht werden, wenn Kanten verstärkt werden. Gleichzeitig ist diese Methode von der Probe selbst abhängig, da scharfe Kanten im Scan vorhanden sein müssen.

Als zweite Auflösungsanalyse wurde eine Fourier-Ring-Korrelation (FRC) berechnet20,21. Dazu wurde das Bild in vier Teilmengen unterteilt, indem jedes zweite Pixel horizontal und vertikal aufgenommen wurde. Der FRC wurde für jede der beiden diagonalen Teilmengen berechnet und gemittelt. Die Auflösung wurde bestimmt, indem der Schnittpunkt eines gefilterten FRC mit einem Voll-Bit- und einem Halb-Bit-Kriterium identifiziert wurde, was bedeutet, dass jedes Pixel einen Informationsgehalt von 1 Bit bzw. 1/2 Bit enthält. Der Vorteil dieser Methode liegt in der Unabhängigkeit von der Probe. Wenn andererseits korreliertes Rauschen eingeführt wird, werden die Ergebnisse verfälscht. Da für die Phasenabfrage die Verarbeitung der rohen Detektorbilder erforderlich ist, sind die Ergebnisse des FRC für kleine UMPA-Fenstergrößen oder kleine Regularisierungsstärken möglicherweise nur annähernd erkennbar.

Andere gängige Methoden, wie z. B. die Analyse des Fourier-Leistungsspektrums34, eignen sich nicht zur Bestimmung der Auflösung eines phasenabgerufenen Bildes, da sie unempfindlich gegenüber möglichen Unschärfen sind, die bei der Verarbeitung entstehen.

Die während der aktuellen Studie generierten und/oder analysierten Datensätze sind auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich.

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Wir danken DESY (Hamburg, Deutschland), einem Mitglied der Helmholtz-Gemeinschaft HGF, für die Bereitstellung der experimentellen Einrichtungen. Teile dieser Forschung wurden an PETRA III durchgeführt und wir möchten Fabian Wilde für seine Unterstützung bei der Nutzung der Beamline P05 danken, die vom Helmholtz-Zentrum Hereon betrieben wird. Strahlzeit wurde für den Antrag LTP II-20190765 zugewiesen. Diese Forschung wurde teilweise durch die bei DESY betriebenen Maxwell-Rechenressourcen unterstützt.

Open-Access-Förderung ermöglicht und organisiert durch Projekt DEAL.

Lehrstuhl für Biomedizinische Physik, Fachbereich Physik, Fakultät für Naturwissenschaften, Technische Universität München, 85748, Garching, Deutschland

Mirko Riedel, Kirsten Taphorn, Alex Gustschin, Madleen Busse & Julia Herzen

Münchner Institut für Biomedizinische Technik, Technische Universität München, 85748, Garching, Deutschland

Mirko Riedel, Kirsten Taphorn, Alex Gustschin, Madleen Busse & Julia Herzen

Institute of Materials Physics, Helmholtz-Zentrum Hereon, 21502, Geesthacht, Germany

Mirko Riedel, Jörg U. Hammel, Julian Moosmann & Felix Beckmann

Institut für Rechtsmedizin, Ludwig-Maximilians-Universität, München, Deutschland

Florian Fischer

Fachbereich Physik, Universität Triest, Triest, Italien

Pierre Thibault

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MR und AG und JH konzipierten das Experiment, MR und JUH führten die Messung durch, MB und FF bereiteten die Probe vor, MR analysierte die Ergebnisse, JUH und JM und FB überwachten die Strahlführung und das Experiment sowie die Datenverarbeitung, PT lieferte den UMPA-Analysecode , MR und KT haben das Manuskript geschrieben. Alle Autoren haben das Manuskript überprüft.

Korrespondenz mit Mirko Riedel.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Riedel, M., Taphorn, K., Gustschin, A. et al. Vergleich der Röntgen-Phasenkontrastbildgebung mit einem Talbot-Array-Illuminator mit der ausbreitungsbasierten Bildgebung für inhomogene biomedizinische Proben. Sci Rep 13, 6996 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-33788-7

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Eingegangen: 16. Januar 2023

Angenommen: 19. April 2023

Veröffentlicht: 28. April 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-33788-7

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